Bead-based protein arrays using protein tag-specific nanobodies

　　使用蛋白標簽特異性nanobodies進行基于珠子的蛋白分析

　　Figure 1 Workflow to generate bead-based protein arrays (BPAs) using tag-specific nanobodies and the application of such BPAs to study protein-protein interactions (PPIs). GFP- or GST-tagged bait-proteins are derived from small-scale expression cultures of bacterial or mammalian cells. Upon incubation of the crude lysates with color-coded beads (CCBs) comprising tag-specific nanobodies, bait-proteins are one-step purified and site-directed immobilized onto individual CCB populations, thereby generating BPAs. In the next step, cell lysates comprising the proteins’ interaction candidates to be analyzed (prey-proteins) are incubated with the BPAs. Finally, levels of prey-protein bound to the individual bait-proteins are quantified using tag- or gene-specific antibodies in a bead array reader.

　　背景

　　關于動態蛋白質-蛋白質相互作用(PPIs)的知識對于了解細胞過程和對這些相互作用的化合物的發現和驗證是至關重要的。Bead-based protein assays(BPAs)是分析bait-蛋白質和prey-蛋白質之間的相互作用的新興方法。然而，大多數研究仍采用細菌衍生的bait-蛋白質，由于它們缺乏轉錄后的修飾，或者在外源表達中不能正確折疊而有使用上的限制。

　　本應用筆記提出了一個新穎的方法來生成BPAs去結合與固定矩陣基質結合的微米級純化的bait-蛋白質。在細菌或哺乳動物細胞內，bait-蛋白質與GST-或GFP-融合結構被生產出，并能使用ChromoTek高親和力的特殊標簽標記蛋白的nanobodies：GFP-Trap®或GST-Trap偶聯的彩色珠子，一步純化及固定溶菌產物。zui后，將這些bait-偶聯的珠子結合在蛋白陣列中，用于小型多重GST -和GFP pulldown實驗。zui近這項技術被成功地應用于研究蛋白酶體抑制或信號通路擾動后內源性prey-蛋白質β-catenin與一系列*的bait-蛋白質相互作用的動態變化(Groll N., et al., 2015) 。

　　結果

　　從細菌或細胞裂解物中，將GST-和GFP-標記的bait-蛋白固定在珠子上，生成一個基于bead的蛋白陣列(BPA)

　　運用原理論證研究測試概述的方法來分析蛋白酶體抑制或信號通路擾動后內源性β-catenin 與一系列*的bait-蛋白質的相互作用。為了生成基于珠子的蛋白陣列(BPAs)，建立了一個兩步法生成*的bait-蛋白質的方法。首先GST-或GFP-特異性nanobodies共價偶聯上彩色編碼珠子(CCBs)。隨后，這些CCBs與油溶性的細菌或細胞裂解產物孵育，包括β-catenin特異性bait-蛋白質ICAT, ECT 和TCF4或者是GST-或GFP-融合結構，相應的bait-蛋白質固定在nanobody包被的CCBs上。CCBs的檢測飽和度為50 µg/ml的總蛋白濃度。因此，BPA生產的標準條件是100 µl 1 mg/ml的油溶性蛋白提取物與大約200000珠子偶聯。顯然，檢測表明不同的CCB集群不發生蛋白轉移，這說明了在一段時間內，不同的珠子集群上的bait-蛋白質是沒有交換的。

　　蛋白質-蛋白質相互作用分析

　　為了確定和比較固定后bait-蛋白質的功能，我們應用BPAs目標多遠分析來檢測復合實驗中綁定的β-catenin的動態變化。β-catenin是標準Wnt通路的關鍵效應分子。β-catenin在細胞中的濃度受細胞質破壞復合體嚴格控制(Liu C, et al., 2002)。由于Wnt受體的外在活性，破壞復合體功能被滅活(Huang H, et al., 2008)，導致細胞質內hypo-磷酸化β-catenin的積累，以及轉位進入細胞核中，在細胞核中它與淋巴增強因子/T細胞因子(LEF/TCF)家族相互作用，從而激活Wnt應答基因的轉錄(Moismann C., et al., 2009) 。除了作為轉錄因子，β-catenin還作為細胞膜與細胞骨架間的受體分子，與細胞黏附蛋白家族鈣粘蛋白,α-catenin和肌動蛋白形成蛋白復合體。

　　在我們的研究中，我們通過針對β-catenin的穩定性調節了標準Wnt通路的活性。因此，我們使用MG132抑制了β-catenin蛋白酶體降解。另外我們使用了GSK3β的特異性抗體CHIR-99021 (CHIR)來阻斷β-catenin的磷酸化及泛素化，從而模擬Wnt通路的狀態(Bennett CN, et al., 2002)。如前所述，我們使用BPAs來監測內源性β-catenin結合性的動態變化，從而選擇復合實驗的bait-蛋白質。因此，用分離自處理或未處理過的HEK293T的 20µg 蛋白提取物與BPAs一起孵育。用MG132和CHIR同時處理，會導致強烈的可測量的內源性β- catenin與三種bait-蛋白質：ICAT, ECT和TCF4的相互作用(Fig.2)。然而，這兩種抑制劑的影響很小，有限數量的β-catenin能被這三種bait-蛋白質捕獲而顯示顯著差異(Fig.2)。

　　Figure 2 Multiplex analysis of β-catenin binding profiles to different bait-proteins upon GSK3β or proteasome inhibition. BPAs comprising the GFP- or GST labeled bait-proteins ICAT (A & D), ECT (B & E) and TCF4 (C & F) were incubated with soluble protein fractions derived from HEK293T cells. To modulate the levels of endogenous β-catenin, HEK293T cells were either left untreated (blank), or incubated with 10 µM MG132 (proteasome inhibitor), or DMSO as a control (A, B and C) or treated with 10 µM CHIR (GSK3β-inhibitor) and H2O as a control (D, E, and F). Bound levels of β-catenin were detected using a monoclonal anti-β-catenin antibody. Shown are mean fluorescence intensities (MFI) and standard deviations of three independent biological experiments. Statistical significance was evaluated with the students t-test (*p≤0.05; **p≤0.01;***p≤0.001).

　　ICAT作為bait-蛋白時，細胞β-catenin水平的明顯增加，而ECT和TCF4作為bait-蛋白時程度較小。值得注意的是,分離自兩個不同的表達系統的標記蛋白的使用，造成了內源性β-catenin結合水平的顯著差異。由于bait-蛋白ECT和TCF4存在，GFP-versions比GST-tagged能夠結合更多的β-catenin。我們的研究結果表明，與相應的GST-fusions相比，GFP-ECT處理后β-catenin信號高出50倍，GFP-TCF4處理后β-catenin信號高出4倍。這表明，當這些bait-蛋白表達并與哺乳動物溶菌產物結合后，它們的功能會提升。

　　結論

　　高親和性特異性標記的nanobodies的應用，能直接從真核生物和原核蛋白表達培養物中產生一種、快速、可再生的基于珠子的蛋白陣列(BPAs)。我們通過分析信號蛋白β-catenin與三種相互作用物的結合表現，展示了真核表達系統的優勢。我們認為這種方法適用于研究細胞通路中蛋白質上的小分子的作用，并通過BPAs為媒介擴展到高通量模式。新的高親和性標記nanobodies對于額外蛋白質或標簽肽的特異性識別，將大大增加這種方法的使用機會。

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